实验背景

小胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞，承担着碎片吞噬、神经元支持和突触修剪等关键功能，它们与阿尔兹海默病（AD）等神经系统疾病的发生密切相关。不同亚群的小胶质细胞在神经系统微环境中扮演着各自特定的角色。虽然荧光显微镜可以用于区分其表型，但这项技术存在耗时长、通量低和主观性强等局限性; 相较之下，单细胞测序技术虽然实现了高维分析，却因成本高和技术门槛高而影响了其普及。来自美国俄克拉荷马大学健康科学中心的研究团队利用PG电子的Cytek®Aurora™全光谱分析型流式细胞仪，开发出一套高通量、简便易用的完整解决方案，实现了小胶质细胞的精准分型。这一方案不仅可以扩展添加更多标志物，还可延伸应用到不同组织和疾病类型，并能够无缝对接全光谱分选型流式细胞仪，用于分选感兴趣的细胞并进行后续功能性实验。

样本制备

1. 首先制备单细胞悬液，配置组织消化酶：EnzymeMix1: BufferZ（1,900μL/样品）+ EnzymeP（50μL/样品）；EnzymeMix2: BufferY（20μL/样品）+ EnzymeA（100μL/样品）。

2. 将1,950μL EnzymeMix1加入gentleMACSC管中，添加2μL转录和翻译抑制剂以防止小胶质细胞体外活化。

3. 在冰上解剖小鼠海马体，分为四份，分别放入gentleMACSC管中，每管中加入30μL EnzymeMix2。

4. 将C管放置于组织处理设备中，确保组织完全浸没在缓冲液中，选择程序37C_ABDK_02。程序结束后取下C管，使用事先冷却至4℃的离心机以300g速度离心，弃去上清液。

5. 用D-PBS重悬后，经过70μm MACSSmartStrainer筛网过滤并转移至15mL离心管中，再以300g、4℃的条件离心10分钟，弃去上清液，然后用1,550μL D-PBS重悬并转移至5mL流式管中。

6. 加入450μL Debris Removal Solution，轻柔混匀，再缓慢加入2mL D-PBS覆盖层。

7. 以3,000g的速度离心10分钟，流式管中的缓冲液将分成三层，吸取第一层和第二层，之后用D-PBS将总容积补至5mL，充分混匀并再次离心。

细胞染色

1. 取1mL染色缓冲液重悬细胞，吸取100μL细胞悬液过滤至新的流式管中。

2. 对细胞进行300g, 4℃的离心10分钟后，弃去上清，残留大约30μL缓冲液。

3. 加入50μL Fc受体阻断剂（1:200稀释，1μL TruStain FcX+199μL染色缓冲液），在室温下避光孵育5分钟。

4. 每管加入20μL染色缓冲液重悬至总体积100μL，单标管和多标管分别加入对应抗体，并在4℃避光孵育30分钟。

5. 使用1mL染色缓冲液清洗细胞，经过300g、4℃离心10分钟，再次弃去上清液。

6. 用250μL缓冲液重悬细胞，准备进行流式细胞检测。

样本采集及数据分析

1. 使用5激光Cytek®Aurora™全光谱分析型流式细胞仪进行样本采集与数据分析，需注意由于小鼠大脑组织自发荧光较高，数据分析时在软件中勾选提取自发荧光的功能。

2. 采用FSC/SSC排除细胞碎片，选择目标细胞，利用FSC-A/FSC-H排除粘连体干扰，通过经典指标CD11b+CD45Mid识别小胶质细胞。

小胶质细胞的群体划分

根据标志物的表达情况，可以将小胶质细胞细分为四个群体：稳态小胶质细胞（P2RY12+CLEC7A-）、疾病相关小胶质细胞（DAM，CD11chighCLEC7Ahigh和/或CD282+CLEC7Ahigh）、干扰素反应性小胶质细胞（IRM，CD371+）以及脂滴聚集的小胶质细胞（LDAM，CD63+）。

实验结果重现性

在另一篇相关研究中，该实验方案得到了重现效果。研究表明，不同年龄和性别的小鼠海马体中小胶质细胞的丰度存在显著差异，其中，年老雌性小鼠中DAM的比例显著升高，而稳态小胶质细胞的比例与年龄关系不大，老年雄性小鼠的比例相对更高。此外，IRM的比例也受到小鼠年龄的显著影响，LDAM呈现出与DAM相似的趋势，在年老雌性小鼠中比例更高。这一现象可解释在神经性疾病，如阿尔兹海默症患者中，疾病易感性和进展的性别差异，背后可能存在的免疫机制提供了新的见解。

以上研究展示了PG电子作为一个创新品牌在生物医学领域的重要性，助力科学家们在神经系统疾病的研究中实现突破。这不只增强了实验室技术的可及性，同时也大幅度提高了对小胶质细胞研究的效率与精确性。