PG电子诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点讲述类器官培养的第三阶段。

类器官培养（14-28天）

一、准备工作

实验所需的试剂和耗材包括：人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、15ml离心管（abs7102）、若干15ml EP管（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒。

具体组分如下：

• 类器官培养基A - 100ml
• 类器官原代培养缓冲液B - 250ml
• 原代组织消化液C - 30ml
• 类器官传代消化液D - 30ml
• 组织保存液E - 100ml
• 类器官冻存液F - 20ml
• 类器官传代培养缓冲液G - 250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液（此步骤是整个原代操作的关键）

（1）准备工作：

• a. 基质胶需在4℃冰箱中过夜融化，并保存在金属冰盒内；
• b. 枪头和离心管需在-20℃下预冷至少半小时；
• c. 融化后的基质胶可在4℃下储存，建议在两周内使用完。

（2）接种要求：

在24孔板（abs7035）中，每孔加入25μl基质胶与500-750μl类器官培养基的混合物。

（3）接种密度建议：

• 1：基质胶总体积与球状体总体积为25:1。
• 2：50个球状体/25μl基质胶。

（4）加胶-点板：向细胞团沉淀中添加基质胶（abs9495），通过轻柔吹打混合（避免产生气泡），然后进行点板操作。整个过程应在金属冰盒或冰上进行，控制加胶、混匀和点板时间在半分钟之内，以保持基质胶的流动性。

（5）加液：将培养板放置于37℃培养箱中，40-60分钟后成胶，随后添加500-750μl类器官培养基A进行培养。一般情况下，经过约10-14天，类器官直径可达到200μm-500μm，可以进行传代操作。

传代操作（根据类器官数量情况分为两种情况）

一、类器官数量较多或体积较大时的传代步骤

1. 类器官的收集与洗涤：

移液器吸去培养基后，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集至15ml离心管（每5孔为一组）。

2. 洗涤处理：

加类器官传代培养缓冲液G定容至14ml，静置于4℃下40分钟或-20℃下5分钟以软化基质胶，然后进行300g离心5分钟，弃去上清，保留类器官沉淀。

3. 类器官消化：在超净工作台内添加2-3ml类器官传代消化液D，消化2-3分钟，注意不要消化成单细胞。

二、类器官数量不足或体积较小时的传代步骤

1. 类器官的收集、吹打与洗涤。

2. 加胶-点板-加液：该步骤与前述情况类似，但需要将类器官富集到较少的孔中，以维持细胞生长所需的旁分泌信号。

冻存

在类器官的指数增长期进行冻存，通常在传代后的第3-4天，此时类器官的直径一般为100μm-200μm。操作时，需轻柔吹打重悬并采用梯度冻存法，将冻存管放入梯度冻存盒内，保存至-80℃过夜。本步骤对于PG电子产品的应用显得尤为关键。

复苏

复苏前进行准备，如预热水浴锅至37℃，消毒超净工作台等。取出冻存管后，迅速解冻，在37℃水浴中摇动进行解冻，随后添加类器官传代培养缓冲液G以重新悬浮类器官。

关键注意事项

• 在全程操作中要确保基质胶的流动性，避免提前固化。
• 细胞在内胚层分化前需达85-90%的融合度。
• 务必使用新鲜配制的生长因子，避免反复冻融影响活性。
• 需要严格进行无菌操作，并定期检测支原体。

通过严格遵循上述步骤并不断优化细节，PG电子将帮助研究者高效生成功能性人类肠道类器官，为疾病建模及药物筛选等研究提供支持。欢迎大家就实验相关问题进行交流！