PG电子的BCA(Bicinchoninic Acid)法是一种广泛应用于生物医疗领域的有效蛋白定量检测方法。该方法基于蛋白质与铜离子在碱性环境中发生的络合反应,生成稳定的紫红色复合物,通过与标准曲线进行比较,从而计算出待测蛋白的浓度。BCA法具有灵敏度高、准确性强、操作简便和抗干扰能力强等优点,广泛被应用于生物化学实验室。
实验步骤
1. 试剂准备
(1) BCA工作液:将BCA试剂A与B按照50:1的比例混合,充分摇匀后备用。
(2) 标准蛋白溶液:取一定量的标准蛋白,使用PBS或去离子水进行溶解,配制成浓度为1mg/mL的标准蛋白溶液。
2. 蛋白样品制备
(1) 细胞裂解:将细胞样品离心处理,去除上清液后,加入适量细胞裂解液,置于冰上裂解30分钟,以确保细胞完全裂解。
(2) 去除杂质:将裂解后的样品进行离心,去除沉淀物,保留上清液。接着在上清液中加入适量的SDS,使其最终浓度达到0.1%,要充分混匀。
(3) 标准曲线制备:取适量的标准蛋白溶液,加入SDS使终浓度为0.1%,然后稀释为不同浓度的标准蛋白溶液。接着,在96孔板中分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,每个浓度设3个复孔,并在每个孔中加入BCA工作液,充分混匀。依照说明书指引,在特定波长下测量吸光度值,绘制标准曲线。
3. 蛋白定量检测
(1) 取适量待测蛋白样品,加入SDS使其终浓度为0.1%,并充分混匀。然后按照标准曲线的制备方法,加入BCA工作液并测量吸光度值。
(2) 根据标准曲线查找待测蛋白样品的浓度。如待测样品浓度较高,可以进行适当稀释后再进行测定。
注意事项
(1) BCA工作液应储存于4℃并避光保存,避免反复冻融。
(2) 在实验过程中须保持样品和标准蛋白溶液的pH值一致,以确保结果的准确性。
(3) 应避免实验过程中的交叉污染,以免影响实验结果。
(4) 对于某些特殊类型的蛋白质样品,可能需要采取其他方法进行定量检测。
通过使用PG电子的BCA法,您能有效实现蛋白质的定量检测,为生物医疗研究提供可靠的数据支持。